Synthetische virale vectoren gegenereerd uit T4-faag zijn veelbelovend voor geavanceerde genafgifte

In een recente studie gepubliceerd in het tijdschrift NatuurcommunicatieDe onderzoekers presenteren een methode voor het bouwen van synthetische virale vectoren (AVV’s) met behulp van de gevestigde structurele componenten van T4-fagen.

stabiel: Ontwerp van bacteriële T4-gebaseerde synthetische virale vectoren om het menselijk genoom te recombineren. Afbeelding tegoed: Kjpargeter/Shutterstock.com

Wat zijn virale vectoren?

AAV’s en lentivirussen (LV’s) zijn aangepast om therapeutisch deoxyribonucleïnezuur (DNA) en RNA te dragen; Virale vectoren gaan echter gepaard met enkele beperkingen. De afgifte van therapeutische genen is bijvoorbeeld beperkt en het is moeilijk om andere therapeutische moleculen op te nemen die essentieel zijn voor complexe reparaties.

T4 is een zeer efficiënt virus met een infectiepercentage van bijna 100% en een snelle replicatiecyclus van 20-30 min/cyclus. Deze kenmerken geven aan dat T4 een uitstekende basis is voor het bouwen van AVV-voertuigen.

Synthese van T4 synthetische virale vectoren

Virusstructuur-nabootsers, bekend als T4-AVV’s, werden gegenereerd door gezuiverde biomaterialen op een sequentiële manier samen te voegen. Een pentamerale vulmotor werd gebouwd bovenop de poort van een lege capside-schaal waaruit deze werd gezuiverd coli geïnfecteerd met de T4-mutante faag. Dit werd bereikt door het gp17-motoreiwit aan het reactiemengsel toe te voegen.

Vreemd DNA wordt in het inwendige van de capsule gebracht door de toevoeging van lineair plasmide-DNA en adenosinetrifosfaat (ATP) aan een assemblagereactie. De T4-verpakkingsmotor brengt op een manipulatieve manier DNA over in de capside door bacteriën te vangen en ze van het ene uiteinde naar het andere over te brengen. De sequentiële pakking van DNA-moleculen kan meerdere keren voorkomen, wat resulteert in een compleet hoofd.

RNA’s, eiwitten en hun complexen binden aan verpakte hoofdmoleculen door interacties met een hoog antigeen buitenste capside (Hoc) en kleine buitenste capside-eiwit (Soc).

De onderzoekers kapselden de moleculen ook in met kationische lipidemoleculen, omdat ze veronderstellen dat de kationische lipiden zich spontaan zullen ophopen op de T4-capside door elektrostatische interacties als gevolg van de hoge dichtheid van negatieve ladingen in de T4-capside. T4-AVV-nanodeeltjes hebben dezelfde structuur als natuurlijk omhulde virussen, inclusief een capside-envelop, een lipidelaag en een verpakt ‘genoom’.

In lipiden ingekapselde T4-AVV’s zijn zeer effectief in het afleveren van genladingen in menselijke cellen. Bovendien transformeerden deze AVV’s, wanneer verpakt met verschillende lineaire plasmiden, op efficiënte wijze reporterplasmiden in HEK293T-cellen.

Gemiddeld bevatte elk nanodeeltje ongeveer vijf deeltjes luciferaseplasmide (Lucy) en groen fluorescerend eiwit (GFP) reporterplasmide. GFP-fluorescentie werd gebruikt om de transductie-efficiëntie te bepalen, die ongeveer 100% was.

Het T4-AVV-transposon werd vergeleken met het veelgebruikte AAV2, beide met dezelfde plasmidesequentie. T4-AVV’s hadden echter vier tot 19 keer hogere luciferase-expressie dan AAV2, wat kan worden toegeschreven aan het vermogen van T4 om ongeveer acht Luci-plasmidemoleculen in elke kop te bundelen, waardoor verschillende kopieën van de genetische lading in één enkele kop kunnen worden afgeleverd. levering. AAV2 is daarentegen beperkt tot het afleveren van één exemplaar tegelijk.

T4-AVV’s zijn uniek vanwege hun grote headercapaciteit die tot ongeveer 171 KB kan bevatten. Dit maakt de afgifte van grote therapeutische genen mogelijk, waaronder het DNA van volledige lengte dat codeert voor het menselijke dystrofine-gen 11 kb, wat niet kan worden bereikt met de huidige LV- en AAV-vectoren.

Genoombewerking van AVV’s

AVV’s zijn gemaakt om verschillende genomen te wijzigen door alle bewerkingsmoleculen samen te voegen tot een enkele AVV met verschillende arrangementen. De eerste set AVV’s bevatte plasmiden met tot expressie gebrachte Cas9-genen en gRNA, waarin de Cas9 N-terminus was gefuseerd met de nucleaire lokalisatiesequentie (NLS) PKKKRKV71 en een geoptimaliseerd codon om NLS-Cas9 te genereren. Vervolgens werd Cas9 verplaatst naar de kern om genoombewerking uit te voeren, terwijl het gRNA werd gericht op de AAVS1 veilige haven locus, of de PPP1R12C locus, op chromosoom 19 van het menselijk genoom.

T4-AVV’s zijn gebruikt om het hemoglobine beta (HBB) -gen op chromosoom 11 van het menselijk genoom te richten om genoombewerking uit te voeren op een therapeutisch belangrijke plaats. AVV’s geassembleerd met Cas9-HBB gRNA ribonucleoproteïne (RNP) -complexen (AVV4) bereikten ongeveer 20-25% bewerking op de doellocatie.

Bovendien werden AVV’s gegenereerd door twee gRNA-RNP-complexen weer te geven op een enkele AVV (AVV5), waarbij het ene complex gericht was op de HBB-site en het andere op de AAVS1-site. Multiplex AVV’s hebben met succes het genoom bewerkt op twee verschillende chromosoomlocaties, ~ 20% op de HBB-site en ~ 30% op de AAVS1-site.

conclusies

Onderzoekers hebben een nieuwe klasse nanomaterialen ontwikkeld, een synthetisch viraal platform op basis van fagen, dat in een reageerbuis kan worden geproduceerd via een lopende band. AVV’s hebben een vergelijkbare structuur als natuurlijke virussen; Er is echter meer onderzoek nodig om te begrijpen hoe ze cellen binnendringen, uit endosomen ontsnappen, uiteenvallen en zich binnen cellen verplaatsen om hun afgifte te verbeteren.

Dit nieuwe platform is klaar voor therapeutisch gebruik en kan defecten in primaire menselijke cellen corrigeren, zowel binnen als buiten het lichaam. Het zal nodig zijn om lipide-nanodeeltjestechnologieën te ontwikkelen en conventionele en regelmatig geassembleerde short palindromic repeat (CRISPR) technische technieken te gebruiken om specifieke payload-ontwerpen te creëren.

Er kunnen met name veiligheidsrisico’s ontstaan ​​tijdens de overdracht van T4-AVV’s in de kliniek, waaronder mogelijke ongewenste reacties van het immuunsysteem van de gastheer of effecten buiten het doelwit. Daarom wordt het T4-AVV-platform momenteel onderzocht op veiligheid en werkzaamheid.