Enzym en eiwitten werken samen om de uiteinden van DNA te rangschikken in delende cellen

Onderzoekers van de Universiteit van Wisconsin-Madison beschrijven de manier waarop een enzym en eiwitten op elkaar inwerken om de beschermende omhulsels, telomeren genaamd, aan het einde van chromosomen te behouden, nieuw inzicht in hoe de menselijke cel de integriteit van zijn DNA behoudt door herhaalde celdeling. .

DNA-replicatie is essentieel om het leven zoals we dat kennen in stand te houden, maar veel van de fijne kneepjes van het proces – hoe de talloze biomoleculen komen waar ze moeten zijn en interageren via een reeks ingewikkeld georkestreerde stappen – blijven raadselachtig.

Zegt Ci Ji Lim, assistent-professor biochemie en hoofdonderzoeker over het nieuwe onderzoek naar DNA-klonering dat onlangs is gepubliceerd in: de natuur temperen. “Onze studie biedt een belangrijke vooruitgang in het begrijpen van DNA-synthese aan de uiteinden van chromosomen en genereert nieuwe hypothesen over hoe Polα-primase – een centraal radertje in de DNA-transcriptiemachine – functioneert.”

Elke keer dat de cel zich deelt, krimpen de telomeren aan het einde van het lange DNA-molecuul dat uit één chromosoom bestaat iets. Telomeren beschermen chromosomen als een asterisk die het uiteinde van een schoenveter beschermt. Uiteindelijk zijn de telomeren zo kort dat de vitale genetische code op het chromosoom zich ontvouwt en de cel, die niet meer normaal kan functioneren, in een zombiestaat terechtkomt. Een deel van het routinematige celonderhoud omvat het voorkomen van overmatige verkorting door dit DNA te regenereren met Polα-primase.

In de telomeer Op de bouwplaats construeert Polα-primase eerst een korte DNA-primer (genaamd RNA) en breidt deze primer vervolgens uit met DNA (toen RNA-DNA-primer genoemd). De wetenschappers dachten dat Polα-primase van vorm zou moeten veranderen wanneer het van RNA naar de structuur van een DNA-molecuul zou gaan. Het laboratorium van Lim ontdekte dat Polα-primase een RNA-DNA-primer maakt bij telomeren met behulp van een stijve steiger met behulp van een ander tandwiel in de telomeertranscriptiemachine, een accessoire-eiwit genaamd CST. CST werkt als een stop-tag en activeert de activiteit van andere enzymen en brengt Polα-primase naar de bouwplaats.

“Vóór deze studie moesten we ons voorstellen hoe Polα-primase zou werken om telomeerreplicatie aan de uiteinden van chromosomen te voltooien”, zegt Lim. “Nu hebben we structuren met hoge resolutie van Polα-primase gehecht aan een extra eiwitcomplex genaamd CST. We ontdekten dat nadat CST zich hecht aan de typische DNA-streng in de telomeer, het de werking van Polα-primase vergemakkelijkt. Daarbij, CST maakt de weg vrij voor Polα-primase om eerst RNA en vervolgens DNA te synthetiseren met behulp van een verenigd architectonisch platform.”

De onderzoekers kregen ook een kijkje in hoe Polα-primase de DNA-synthese elders op het chromosoom initieert. Andere wetenschappers hebben het CST-pol-α-primase-complex ook ontdekt op plaatsen waar DNA-schade is hersteld en waar DNA-replicatie is gestopt.

“Omdat Polα-primase een zeer centrale en belangrijke rol speelt bij DNA-replicatie op telomeren en elders langs chromosomen – het is het enige enzym dat vanaf het begin primers op DNA-templates maakt voor DNA-replicatie – biedt de CST-Polα-primase-structuur nieuwe inzichten in hoe Polα-primase ook zijn functie kan uitoefenen tijdens genomische DNA-replicatie”, zegt Lim. “Het is een zeer elegante oplossing die door de natuur is ontwikkeld om dit complexe proces te volbrengen.”

“Onze bevindingen onthullen een ongekende rol die CST speelt bij het faciliteren van Polα-primase-activiteit”, legt eerste auteur Qixiang He uit, een afgestudeerde student in het UW-Madison Biophysics Graduate Program. “Het zal interessant zijn om te zien of cofactoren die betrokken zijn bij DNA-replicatie elders op chromosomen Polα-primase creëren op dezelfde manier als CST werkt met telomeren.”

De onderzoekers bouwden het structurele model van CST – Polα-primase met behulp van een geavanceerde beeldvormingstechniek genaamd cryo-elektronenmicroscopie met één deeltjesanalyse. In cryo-EM worden bevroren monsters snel gesuspendeerd in een dunne laag ijs en vervolgens afgebeeld met a transmissie elektronenmicroscoopresulterend in 3D-modellen met hoge resolutie van biomoleculen zoals de enzymen die betrokken zijn bij DNA-replicatie.

Het team van Lim gebruikte cryo-EM-single-particle-analyse om eerst de structuur van de CST-Polα-primase te bepalen en vervolgens de bewegende delen van het complex in meer detail te visualiseren. Ze verzamelden de gegevens in het onderzoekscentrum voor cryo-elektronen- en elektronenmicroscopie (CEMRC) van de Universiteit van Wisconsin-Madison, gevestigd in de afdeling Biochemie van de Universiteit van Wisconsin-Madison, en de door het National Cancer Institute gefinancierde cryo-elektronenmicroscopie faciliteit in het Frederick National Cancer Research Laboratory.

“We begonnen met een puzzel van onze biochemische testen, maar zodra we het CST-pol-α-primase co-complex in beeld hadden en de cryogene structuren ervan zagen, werd alles meteen duidelijk. Dit was zeer bevredigend voor iedereen in het team. Na dat, zegt Xiuhua Lin, laboratoriumdirecteur en co-auteur van de nieuwe studie, zei dat de structuren ook ideeën bieden die we nu kunnen ontwerpen om experimenten te testen.

Leg onder deze ideeën vast hoe CST-pol-α/primase in meer detail werkt. De onderzoekers willen ook de hele menselijke telomeer in kaart brengen Herhaling proces, en ze bestuderen hoe CST-pol-α/primase zijn activiteit beëindigt zodra DNA is getranscribeerd op telomeren.

“Je kunt niet echt bestuderen hoe een auto beweegt door naar de afzonderlijke onderdelen te kijken – je moet de onderdelen samenvoegen en kijken hoe ze samenwerken. Maar vaak hebben biomoleculaire machines zoveel bewegende delen dat ze moeilijk te bestuderen zijn,” hij zegt. “Dit is waar de kracht en veelzijdigheid van cryogene technologie van pas komt –Elektronen microscoop De één-deeltjesanalyse komt eraan. Deze benadering stelde ons in staat om een ​​atomair model met hoge resolutie samen te stellen en kritische inzichten te verschaffen in hoe het beweegt, wat op zijn beurt ons begrip van de werking van menselijke CST-Polα-primase vergemakkelijkte. ”